La droplet digital PCR (ddPCR) es una tecnología de última generación que está siendo utilizada en distintos campos científicos incluida la patología vegetal para la cuantificación de ADN, mostrándose como una técnica más sensible que la PCR a tiempo real (qPCR), permitiendo una cuantificación absoluta del ADN de organismos en muestras ambientales.
El objetivo de este estudio fue poner a punto un protocolo de cuantificación absoluta de hongos asociados al pie negro de la vid basado en la tecnología ddPCR, y comparar su eficiencia y sensibilidad con la qPCR. Este trabajo se realizó en colaboración con la “Estación de Viticultura e Enoloxía de Galicia” (EVEGA-AGACAL) y BIODONOSTIA-Instituto de Investigación Sanitaria (San Sebastián). El estudio se realizó en La Rioja, en 5 viñedos jóvenes cultivar ‘Tempranillo’ injertado sobre el portainjerto 110 Richter, de características edáficas similares. En cada viñedo se seleccionaron al azar cuatro puntos y en cada punto se recogieron tres muestras: suelo, rizosfera (suelo que rodea las raíces) y raíz (endorizosfera).
Los resultados mostraron que tanto la ddPCR como la qPCR mostraron ser técnicas eficientes para detectar y cuantificar ADN de formas asexuales similares a “Cylindrocarpon-like” asociadas a la enfermedad del pie negro. Ambos métodos mostraron una buena linealidad dentro del rango de cuantificación con un alto coeficiente de correlación de las curvas estándar (R2=0,9917 y 0,9893), y eficiencias de 0,83 y 0,97 para ddPCR y qPCR, respectivamente. La ddPCR resultó ser una técnica más sensible presentando un límite de detección de 5 fg μl-1 frente a 10 fg μl-1 detectados mediante qPCR. Además, los resultados de la cuantificación con ambas técnicas mostraron una correlación significativa (R2=0,95)
La ausencia de diferencias significativas en las concentraciones de hongos asociados al pie negro entre suelo, rizosfera y endorizosfera, obtenidas tanto por ddPCR y por qPCR, indican que los compartimentos suelo-planta no afectan a la abundancia de estos hongos en vides asintomáticas. Esto puede ser explicable por la existencia de una alta presión de estos hongos en el suelo. Estos hongos que pueden proceder de la incorporación a los suelos de restos de vides infectadas o de vegetales de los que son huéspedes habituales, como cereales o Brasicáceas que suelen ser utilizados en la rotación del cultivo en viveros, tienen la capacidad de formar clamidosporas, formas de resistencia que perviven en el suelo durante años en ausencia de huésped. Por otra parte, la presencia de estos hongos como endófitos también podrían explicar las elevadas concentraciones encontradas en plantas asintomáticas, desencadenando la enfermedad bajo condiciones de estrés biótico y/o abiótico.
Este es el primer estudio de cuantificación absoluta de hongos asociados al pie negro, y constituye el punto de partida para la utilización de la ddPCR en la cuantificación de otros grupos de hongos asociados a EMV. Estas nuevas metodologías podrán resultar muy útiles en diferentes aspectos relacionados con estas enfermedades incluyendo la adecuada toma de decisiones para su manejo.
Más información:
Martínez-Diz, M. P., Andrés-Sodupe, M., Berbegal, M., Bujanda, R., Díaz-Losada, E., Gramaje, D. 2020. Droplet digital PCR technology for detection of Ilyonectria liriodendri from grapevine environmental samples. Plant Disease 104:1144-1150.
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